HVA ER PCR? HVORDAN FUNGERER PCR? HVORDAN FUNGERER PCR? Ekstraksjon av DNA: Før det er mulig å sette i gang PCR, må DNA- eller RNA-tråden gjøres tilgjengelig og iso- leres. Denne prosedyren avhenger av typen prøvemateriale. Det ekstraherte DNAet og primerne blandes med nukleotider og DNA- polymerase. DNA-polymerasen er et enzym som setter sammen en ny DNA- tråd basert på den gamle. Polymerasen er varmestabil for å tåle temperaturene som brukes i PCR-maskinen. Det er tre trinn i PCR-reaksjonen: 1. Denaturering: PCR-maskinen varmer opp prøven til over 90 °C, noe som forårsaker en denaturering som får DNA-tråden til å skille seg i to enkelttråder. 2. Annealing - Påsetting av primere: Maskinen avkjøler prøven igjen, og primerne binder seg til sin egen målsekvens på DNA-strengen. 3. Forlengelse: Temperaturen heves igjen, DNA-polymerasen fungerer effektivt for å sette nukleotider i forlengelse av primeren, og DNA- tråden kopieres. 10 / frederiksen-scientific.no Målsekvensen du ønsker amplifisert velges. To primere, rettet mot denne sekvensen fra henholdsvis 3'- og 5'-endene av DNA-tråden, velges. Disse primerne er kjemisk syntetisert og inneholder vanligvis mellom 20 og 45 basepar. (Hvis RNA analyseres i stedet for DNA, lages først en komplementær kopi av RNA-sekvensen, slik at man får en se- kvens som ligner på det to-trådete DNA) Et reagensrør med blandingen plasseres i en PCR-maskin. PCR -maskinen er en enkel maskin som inneholder en plate med holder for reagensglass, og fungerer ved at den raskt kan varme og avkjøle prøven i forhåndsprogrammerte sykluser. PCR-reaksjonen gjentas i et visst antall sykluser, og DNA- eller RNA-tråden til prøvematerialet er tilstrekkelig amplifi- sert. Jo flere ganger syklusen gjentas, jo flere DNA-kopier blir det laget. Separasjon av DNA-fragmenter gjøres vanligvis ved hjelp av gelelektroforese. Her blir den amplifiserte kopien av DNA- eller RNA-strengen isolert som et bånd i en gel som deretter kan farges og visua- liseres med en lysplate (transilluminator).
Last ned PDF-fil